Активные формы кислорода

   Кислород является одним из самых распространенных химических элементов биосферы. Давно известно, что кислород воздуха обладает токсическим действием. В начале второй половины 19 века это было доказано Пастером строго поставленными экспериментами. Однако молекулярный кислород сам по себе обычно не вступает в неконтролируемые химические реакции внутри организма. Повреждающими агентами являются активные формы кислорода, образующиеся в ряде физико-химических процессов в организме. Активные формы кислорода - это соединения, которые являются сильными окислителями или крайне реакционноспособными свободными радикалами. Они содержат неспаренные электроны и потому отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью, несмотря на короткий период жизни в растворе (табл. 1). За очень короткий период они либо рекомбинируют друг с другом, либо реагируют с растворенным субстратом. Однако не все АФК являются свободными радикалами (перекись водорода, синглетный кислород) и не все кислородсодержащие радикалы относятся к АФК (NO^·). В настоящее время для объединения широкого класса кислородсодержащих соединений радикальной и нерадикальной природы был предложен термин 'активированные кислородные метаболиты' (АКМ) [Меньщикова и др., 1994] к которым относят: супероксидный анион-радикал ( ), гидроперекисный радикал (НО₂^·), перекись водорода (Н₂О₂), гидроксильный радикал (ОН^·), синглетный кислород (¹О₂), окись азота (NO^·), алкоксильные (RO^·) и перекисные (RO₂^·) радикалы, гипогалоиды (HOCl, HOBr, HOI). В монографии Зенкова Н.К. и соавт. 'Окислительный стресс' приводится краткое описание истории возникновения и развития свободнорадикальной биологии [Зенков и др., 2001]. Считается, что свободнорадикальная биология имеет две линии зарождения: первая линия идет от Лавуазье, а вторая от Гомберга, хотя точных исторических корней свободнорадикальная биология не имеет [Зенков и др., 2001]. Впервые реакционная способность кислородных радикалов была выявлена Фентоном в 1894 году. Он показал, что окислительная способность перекиси водорода значительно возрастает в присутствии сульфата железа. Габер и Вейс показали, что высокая реакционность раствора перекиси водорода и сульфата железа обусловлена образованием гидроксильных радикалов.

Таблица 1. Значения времен жизни и радиусов диффузии АКМ в биологических субстратах (по Зенков и др., 2001).

Михаэлис утверждал, что абсолютное большинство химических реакции протекает через участие свободных радикалов. Гершман и др. впервые предположили, что токсическое действие кислорода и радиоактивное облучение имеют общий биологический механизм, который обусловлен образованием свободнорадикальных молекул [Зенков и др., 2001]. После создания атомного оружия исследования, проведенные в 50-60-х годах показали, что биологическое действие ионизирующего излучения в значительной степени реализуется через образование различных радикалов обусловленных радиолизом молекул воды [Ярмоненко, 1988; Пикаев, 1986]. Тарусов выдвинул концепцию свободнорадикальной патологии [Тарусов, 1957]. Однако, только с 1969г., когда была открыта энзиматическая функция супероксиддисмутазы (СОД) начинается современная эра исследования биологической роли АФК. Так, с помощью СОД, а впоследствии и других агентов, стало возможным выяснение роли АФК в биологических объектах и их использование в качестве инструментов для идентификации молекул АФК и доказательства их участия в реакции. Эмануэль высказал предположение о связи образования в организме свободных радикалов и канцерогенеза [Эмануэль и Липчина, 1958]. В 1972-1973 году были показаны положительные свойства свободных радикалов на примере дыхательного 'взрыва' [Babior et al., 1973].

В 1987 была выявлена жизненно важная регуляторная роль кислородных радикалов - было показано, что эндотелиальный фактор релаксации сосудов есть не что иное, как NO-радикал [Ignarro et al.. 1987; Palmer et al., 1987]. Как известно, АФК образуются под воздействием экзогенных и эндогенных факторов. К экзогенным факторам относят действие как физических факторов, таких как ионизирующая радиация, так и действие химических веществ. В норме, активные формы кислорода вырабатываются в организме при аутоокислении катехоламинов, флавинов, хинонов и тиолов, при окислении гемоглобина и миоглобина, в процессе синтеза простангландинов, лейкотриенов и тромбоксанов, в результате респираторного взрыва фагоцитирующих клеток, при восстановлении кислорода в дыхательной цепи митохондрии, а также при окислении ксенобиотиков и эндогенных субстратов в митохондриальной цепи транспорта электронов [Синицкая и Хавинсон, 2002; Меньщикова и др., 2002]. По оценке Эстербауэра [Esterbauer, 1993], человек за 70 лет жизни потребляет около 17 тонн кислорода; за это время в его организме нарабатывается от 800 до 1700 кг кислородных радикалов. Располагая большим количеством энергии, АФК легко могут привести к разрыву химических связей в жизненно важных макромолекулах. В нормальной клетке избыток активных форм кислорода устраняется многоступенчатой системой антиоксидантной защиты [Mates and Sanchez-Jimenez, 1991].

1.1. Синглетный кислород (¹О₂)

   Синглетный кислород может находиться в двух состояниях: ¹Sg⁺ и ¹Dg. Переход молекулы кислорода ( ³Sg) к возбужденному синглетному состоянию (¹Dg) происходит при изменении спина одного из его электронов, находящихся на
p*-орбиталях. Время жизни синглетного кислорода в жидкой фазе ('10^-12 с) [Разумовский, 1979] меньше чем в газообразной среде (' 0,047-0,092 с) [Midden and Dahl, 1992]. Время жизни синглетного кислорода в биологических субстратах составляет ~10^-6 с, радиус диффузии 0,3 мкм [Зенков и Меньщикова, 1993]. Энергия синглетного кислорода ¹DgО₂ на 96,3 кДж/моль превышает энергию триплетного состояния. В живых организмах 'специализированные наработки' синглетного кислорода не известны, за исключением грибов вида Cercospora, которые для своей защиты синтезируют белок церкоспорин, вызывающий фотоиндуцированное образование  и ¹О₂ [Daub et al., 1992]. Но как сопутствующий продукт, он образуется в организме при многих ферментативных реакциях: реакции разложения перекиси водорода каталазой, реакция диспропорционирования, реакции с участием миелопероксидазы, реакция Габера - Вейса, реакция гидроксильного радикала с супероксид-анион радикалом и др. (рис. 1).

Рис. 1. Основные реакции, приводящие к образованию синглетного кислорода

1)      реакции диспропорционирования

 +  + 2Н⁺ R Н₂О₂ + ¹О₂;

Н₂О₂ + Н₂О₂ R 2Н₂О + ¹О₂

2)       реакции с участием миелопероксидазы (МПО)
Н₂О₂ + Cl      Н₂О +
 + Н₂О₂ R + Н₂О + ¹О₂

3)      реакции разложения перекиси водорода каталазой
2Н₂О₂     2Н₂О + ¹О₂

4)      реакция Габера - Вейса
 + Н₂О₂ R  +  + ¹О₂

5)       реакция гидроксильного радикала с супероксид-анионом
^- +        Н₂О + ¹О₂.

Ингибиторами (тушителями) синглетного кислорода in vivo являются фенольные антиоксиданты [Красновский, 1994], полиеновые углеводороды [Осипов и др., 1990]. Ингибиторами in vitro являются азид натрия, гуанозин. Для регистрации синглетного кислорода используются следующие методы:

1.      Методы, основанные на фотодинамической инактивации щелочной фосфатазы [Yadav and Jain, 1994].

2.      Методы, основанные на химическом окислении синглетным кислородом диенов, олефинов, билирубина и 2,5-диметилфурана [Thom and Elbuken, 1991].

3.      Методы, основанные на использовании флуоресцентных красителей [Umezawa, 1999].

4.      Биохемилюминесцентные методы [Cadenas and Sies, 1986.; Kanofsky, 1988].

5.      Хемилюминесцентные методы, основанные на хемилюминесценции в результате взаимодействия с аналогами люциферина [Takahama, 1993; Suzuki et. al., 1991 ab], производными изолюминола [Hosaka et. al., 1999],
1,8-нафталимидов [Adam et. al., 1993] и бенз[a]пирен-7,8-дигидродиолом [Teixeira et. al., 1999].

Обладая высокой реакционной способностью, синглетный кислород вступает в самые различные окислительные реакции с различными органическими соединениями: принимает участие в повреждении нуклеиновых кислот и канцерогенезе [Eisenberg et. al., 1992], в инициировании ПОЛ и в возникновении биохемилюминесцеции [Журавлев, 1983], ингибирует Са²⁺ - АТФазу [Kukreja et. al., 1992]. Синглетный кислород агрессивен в отношении биосубстратов, в особенности в отношении молекул с двойной связью; конечным итогом таких реакций обычно является образование гидроперекисей органических молекул - один из важнейших в процессах перекисного окисления ненасыщенных липидов в биомембранах [Осипов и др., 1990]. Наряду с этим синглетный кислород рассматривается как один из главных микробицидных агентов фагоцитирующих клеток [Tatsuzawa et al., 1999]. Основное биологическое значение синглетного кислорода становится существенным при различных фотоиндуцированных процессах, в частности - фотосенсибилизации [Зенков и др., 2001]. Явление фотосенсибилизации лежит в основе фотодинамической терапии опухолей [McCaughan, 1999].

1.2. Супероксид - анион радикал ( )

Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксид - анион радикала. В силу меньшей химической активности  более стабилен, находясь в протонированной форме ( ), который так же как и Н₂О₂, не имеет заряда и может проходить через мембрану [Lynch and Fridovich, 1978]. Основным источником образования супероксид-анинон радикала являются ферментативные системы: НАДФ-оксидаза фагоцитирующих клеток (моноциты, гранулоциты, перитонеальные и альвеолярные макрофаги), ксантиноксидаза, митохондриальная цитохром-с-оксидаза и микросомальные миелооксидазы [Sohal et al., 1989; Владимиров и др., 1991 ab]. В клетках супероксид-анинон радикал является продуктом промежуточных биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков [Зенков и др., 2001]. Согласно [Halliwell, 1994] в организме человека за счет перехода на молекулярный кислород электронов с митохондриальной и микросомальной электрон-транспортных цепей за год образуется около 2 кг супероксид-анион радикала. Для регистрации супероксид-анион радикала используются следующие методы:

1.      Реакция восстановления цитохрома с с изменением поглощения при 550 нм и 418 нм [Cohen, 1986; Johnston, 1984; Fridovich, 1986; Butler et. al., 1982; Suzuki and Ford, 1991]

2.      НСТ-тест: восстановление красителя нитросинего тетразолия или иодонитротетразолия [Prodczacy and Wei, 1988] до формазана, который регистрируется спектрофотометрически при 516 нм либо методом световой микроскопии подсчетом нерастворимых гранул [Bagchi et. al., 1993; Маянский и Маянский, 1989; Цой и Овчинников, 1991; Rock et. al., 1985].

3.      Хемилюминесцентные методы, основанные на регистрации свечения, которое возникает в реакциях супероксид-анион радикала с различными люминофорами, такими как люминол [Pronai et. al., 1991], люцигенин [Cree et. al., 1989; Kahl et. al., 1986], люциферина и его аналогов [Muller et. al., 1989; Kricka, 1993; Pronai et. al., 1991.; Suzuki et. al., 1991ab].

4.      Методы визуальной количественной оценки, основанные на сочетании микроскопии и хемилюминесценции [Suzuki et. al., 1994]

5.      Метод ЭПР [Nakazawa et. al., 1988; Thornalley and Bannister, 1986] или его сочетание с использованием различных спиновых ловушек, таких как гидроксиламин 1-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-4-оксопипередин(7), тирон [Леденев и Рууге, 1985; Пучнина и др., 1992], 5-диэтоксифосфорил-5-метил-1-пирролин-N-оксид [Roubaud et al., 1998].

6.      Спектрофотометрический метод, если удается повысить концентрацию супероксид-анион радикала, по поглощению в области 245 нм [Владимиров и др, 1991; Marklund, 1976].

7.      Амперометрический метод на основе графитного микроэлектрода [Tanaka et al., 1991].

8.      Флуорометрические методы, основанные на использовании
1,3-дифенилизобензофурана [Ohyashiki et al., 1999], 4-метил-b-D-умбеллиферил глюкопиранозида [Lin and Kapoor, 1991], гидроэтидина [Бизюкин и Коркина, 1994].

Генерация  играет важную роль в реализации микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия фагоцитов. Участвует в наработке хемотоксических белков, индуцирует интерлейкин-1подобного фактора, усиливает пролиферацию лимфоцитов [Зенков и др., 2001]. При взаимодействии с эндотелиоцитами приводит к угнетению синтеза РНК [Junod, 1987].  может окислять и восстанавливать ионы металлов переменной валентности. Кроме того,  и сам может вызвать окислительную модификацию липопротеинов сыворотки и нуклеотидов [Yamane, 1987; Fridovich, 1986].

1.3. Перекись водорода (Н₂О₂)

   Перекись водорода образуется путем присоединения двух электронов к молекуле кислорода с образованием двухзарядного аниона  и последующим присоединением протонов [Метелица, 1982; Byczkowski and Gessner, 1988]. В живых организмах перекись водорода образуется в результате ферментативных реакции с оксидазами путем переноса двух электронов на молекулу кислорода, а также в реакции дисмутации  катализируемой супероксиддисмутазой [Sohal et al., 1990]. Для регистрации перекиси водорода используются следующие методы:

1.      Спектрофотометрический метод (e₂₄₀=46,3 М^-1).

2.      Амперометрический метод, с помощью специально разработанных биосенсоров [Bifulco et al.,1994]

3.      Полярографический метод, основанный на разложении каталазой с образованием молекулярного кислорода.

4.      Колорометрические методы, основанные на регистрации окрашенных продуктов при окислении фенола в присутствии пероксидазы хрена [Pick and Keisari, 1980], скополетина, ферроцианида [Владимиров и др., 1991], титано-порфириновых комплексов [Matsubara et al., 1992].

5.      Метод проточной цитофотометрии, основанный на окислении 2^',7^',-дихлорофлюоресцина [Katsura et. al., 1992; Zeller et al., 1989; Babo and Charbonneau, 1994]

6.      Фотохимический метод [Perez-Ruiz et al., 1992]

7.      Хемилюминесцентные методы, основанные на регистрации свечения, возникающего в реакции с бис(2,4,6-трихлорфенил)оксалатом, либо в системе люминол-перекись водорода-катализатор [Владимиров и Шерстнев, 1989; Wymann et al., 1987; Williams and Chance, 1983; Fritzsche and Deweck, 1988].

   Известно, что перекись водорода обладает цитотоксическим действием (при образовании ОН^· в реакциях Фентоновского типа). Например, в патофизиологически достижимых концентрациях (миллимолярные) Н₂О₂ вызывает гибель клеток в культуре фибробластов [Simon et al., 1981], гепатоцитов [Rubin and Farber, 1984], гладкомышечных клеток [Ager and Gordon, 1984], эндотелиоцитов [Debono and Yang, 1995], NK-клеток [Hansson et al., 1995], опухолевых клеток [Lennon et al., 1991] и
Т-лимфоцитов ВИЧ-инфицированных людей [Sandstrom et al., 1993], а также вызывает образование однонитевых разрывов в ДНК [McDonald et al., 1993]. Перекись водорода участвует в индукции и ингибировании апоптоза, хотя механизмы не ясны [Borutaite and Brown, 2001]. Было показано, что Н₂О₂ ингибирует активность рекомбинантной каспазы-3 и каспазы-8 [Borutaite and Brown, 2001]. Показано, что перекись водорода может снижать цитотоксический эффект фактора некроза опухоли, защищая клетки от повреждения [Baud et al., 1990]. Показана регуляторная роль перекиси водорода для синтеза меланина в коже [Karg et al., 1993], возможная роль в регуляции уровня глутатионпероксидазы и каталазы [Зенков и др., 2001]. Перекись водорода ингибирует трансмембранный перенос ионов вследствие индукции процессов ПОЛ [Demiera and Rudy, 1992]; активирует фосфолипазу D₂ [Oh et al., 2000]; инактивирует ингибиторы протеиназ [Wu and Pizzo, 1999]; инактивирует каталазу, глутатионпероксидазу, Cu, Zn-СОД [Pigeolet et al., 1990; Salo et al., 1990]. Некоторые живые организмы (жук-бомбардир) способны накапливать и хранить высокие концентрации перекиси водорода. Для защиты выбрасывает специальную жидкость (25 % Н₂О₂, 10 % гидрохинона и метилгидрохинона + каталаза и пероксидаза) высокой температуры (100°С).

1.4. Гидроксильный радикал (ОН^·)

   Считается, что ОН^· ‑ самый реакционноспособный радикал среди АФК и именно он является конечной причиной большинства повреждений, обусловленных АФК [Пескин, 1997]. Время жизни гидроксильного радикала в биологической среде по разным оценкам колеблется от 2 х 10^-9 до 8 х 10^-9 с, а радиус диффузии <0,01 мкм [Зенков и др., 2001]. В клетке контроль образования ОН^· осуществляется путем регуляции уровня  и перекиси водорода, а также связыванием ионов металлов. В биологических системах основным источником образования гидроксильных радикалов служит реакция Фентона с участием ионов металлов переменной валентности: Н₂О₂ + Fe²⁺ R Fe³⁺ + OH^· + OH^-; в реакции Габера-Вейса:

 + Н₂О₂ R  +  + ¹О₂; при взаимодействии HOCl с .

Для регистрации гидроксильного радикала используются следующие методы:

1)      Метод ЭПР в реакции Фентона [Croft et al., 1992] и в сочетании с различными спиновыми ловушками [Cohen et al., 1988; Pou et al., 1989].

2)      Метод газовой хроматографии основанный на определении продуктов реакции окисления метионаля и его аналогов, третбутанола, диметилсульфоксида [Cohen et al., 1988].

3)      Колориметрический метод, основанный на определении продуктов реакции окисления метансульфоновой кислоты [Popham and Novacky, 1991]

4)      Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии [Fukui et al., 1993]

5)      Метод, основанный на измерении флуоресценции продукта гидроксилирования терефталевой кислоты [Barreto et al., 1994].

   Основные типы повреждений биомолекул гидроксильными радикалами: отрыв атома водорода (таким образом повреждается лецитин - главный компонент биологических мембран, а также сахара в составе нуклеозидов ДНК); присоединение к молекулам по двойным связям (взаимодействие с пуринами и пиримидинами ДНК и РНК, в том числе с образованием вторичных радикалов); перенос электронов также является патогенным механизмом действия ОН^· [Подколзин и др., 2000; Донцов и др., 2002]. В образовании гидроксильного радикала важное значение имеют ионы металлов с переменной валентностью, в первую очередь ионы железа [Подколзин и др., 2000; Донцов и др., 2002]. Это объясняется тем, что ионы железа входят в большом количестве в состав крови (гемоглобин, миоглобин и пр.) где они находятся в связанной форме с трансферрином [Подколзин и др., 2000; Донцов и др., 2002]. Являясь сильным окислителем, гидроксильные радикалы разрывают любую СН-связь, вызывают повреждения белков и нуклеиновых кислот. Цитотоксическое и канцерогенное действие ионизирующих излучений на живые организмы напрямую связывают с генерацией OH^· в процессе радиолиза воды.

1.5. Биологическая роль АФК

   В настоящее время показано участие АФК в патогенезе свыше 100 заболеваний и патологических состояний: болезни сердечно-сосудистой системы, бронхо-легочные заболевания, заболевания нервной системы и др. [Коркина и др., 1998; Владимиров и др., 1991; Castellani et. al., 1995; De Sole et. al., 1989; Halliwell and Grootveld, 1987; Kehrer and Smith, 1994]. Это можно объяснить тем, что все клетки живого организма способны генерировать АФК и соответственно развитие окислительного стресса возможно во всех органах. Однако, наряду с этим, в последнее время выявлен широкий спектр физиологических эффектов АКМ: регуляция клеточной пролиферации и тонуса сосудов, микробицидное действие (явление дыхательного 'взрыва'), функционирование в качестве вторичных внутриклеточных мессенджеров, индукция синтеза белков теплового шока и т.д.

В умеренных концентрациях оксид азота, супероксид-анион радикал и остальные активные формы кислорода играют важную роль в качестве регуляторных посредников в процессах клеточной сигнализации [Droge, 2002]. Высшие организмы используют активные формы кислорода в качестве сигнальных молекул и при других физиологических функциях [Droge, 2002]. Принято считать, что основными хемоаттрактантами в развивающемся очаге воспаления являются медиаторы воспаления, например ланотриен В₄, при этом эндогенные АФК могут как стимулировать, так и угнетать этот процесс [Гольдштейн, 2002]. Обнаружено, что атмосферный супероксид радикал может играть самостоятельную роль в иниицровании хемотоксических эффектов перитонеальных макрофагов мышей in vitro [Гольдштейн, 2002]. Была выдвинута гипотеза, согласно которой химическая активность вдыхаемого радикала супероксида может происходить уже на уровне рецепторных структур слизистой оболочки полости носа. В таком случае биологические эффекты отрицательных аэроионов и атмосферного супероксид радикала рассматриваются как результат модуляции активности нервных центров и структур мозга, которые анатомически и функционально связаны с хеморецепторами носа [Гольдштейн, 2002]. При этом Гольдштейн [Гольдштейн, 2002] ссылается на исследования [Бут, 1966] где говорится, что рецепторные структуры полости носа связаны с сенсорными входами основного подкоркового центра нейрогуморальной регуляции - гипоталамуса. Приводятся результаты [Гольдштейн, 2002] исследований терапевтического применения газо-фазного экзогенного супероксида и низкодозированной Н₂О₂ для лечения бронхиальной астмы, боли и болезни Паркинсона [Goldstein et al., 1996]. Эти данные могут служить хорошим примером терапевтической активности атмосферного супероксида. В работе [Litvinova et al., 2002] показано, что ингаляция низких концентраций АФК (супероксид-анион радикала и перекиси водорода) содержащихся в отрицательных аэроионах приводит к генерации перекиси водорода в митохондриях. Известно, что длительное пребывание в замкнутых пространствах без естественной вентиляции воздуха при сохранении гигиенических норм основных параметров воздушной среды приводит к ухудшению самочувствия, повышенной утомляемости и снижению трудоспособности [Гольдштейн, 2002]. Подобные симптомы наблюдаются у людей работающих в кондицианированных помещениях [Минх и др., 1987], т.к. считается, что кондицианирование воздуха способствуют уменьшению количества аэроионов в воздухе [Геллер и др., 1982]. Эти данные свидетельствуют о физиологической потребности в аэроионах. Убедительные доказательства потребности животных в супероксиде атмосферного воздуха получены в исследованиях при полной элиминации этого фактора из вдыхаемого воздуха [Гольдштейн, 2002], где показано, что депривация атмосферного супероксида ведет к 100 % гибели мышей и крыс в течение 16-23 суток. Таким образом, процессы с участием АФК являются неотъемлемым звеном существования живых организмов [Зенков и др., 2001].